NPTX1是神经元五聚体（neuronal pentraxins，NPs）卵白家眷中的一员，是一种伏击的神经系统分泌卵白。在神经系统发育分化历程中，干细胞抒发或胞外开端的NPTX1可请示干细胞分化成为神经细胞[1]。NPTX1主要在海马、小脑和大脑皮层神经元中抒发[2]白丝 hentai，参与调控神经突触重塑[3]和神经元凋一火[4]等生物历程。NPTX1突变或抒发水平改变可导致多种疾病，如共济失调[5-6]、动眼进攻[7]等，与NPTX1内突变关系。NPTX1在胶质瘤[8]、胰腺癌[9]、肺癌[10]、结直肠癌[11]、宫颈癌[12-13]等肿瘤中抒发显着下调，上调NPTX1抒发则可扼制该类肿瘤的蜕变或镌汰其侵袭性；而在胃癌[14]、胸腺瘤[15]等肿瘤中，NPTX1抒发显着上调，并与肿瘤蜕变或不良预后关系。

增强子是一类可远距离调控基因抒发水平的短DNA序列，在调控基因抒发的历程中有伏击作用[16-18]。增强子调控基因抒发的机制之一是被转录因子识别和和解，使得基因抒发随细胞内转录因子谱的变化而改变[19]，继而影响生物体的发育和疾病的发生发展[20-21]。转录因子常学问别6~12 bp长的DNA序列并和解到DNA上，是以增强子内如有突变，或增强子发生拷贝数变异，该增强子靶向调控的基因的抒发模式可能会改变，继而导致发育格外或疾病，如PAX6远端增强子内的单核苷酸突变与虹膜发育不全高度关系，即增强子活性下落，PAX6抒发量镌汰，导致虹膜发育不全[22]；SNCA和PTF1A远端增强子的单碱基对点突变可在不引起关系卵白序列改变的情况下，引起荒疏性帕金森病和胰腺发育不全[23-24]；超等增强子的丢失或赢得，也与多种癌症的发生关系[25-26]。NPTX1在多种肿瘤组织中抒发下调，其中一种机制是其运行子区域甲基化水平升高[9-11]，而NPTX1关系增强子的武断过火与疾病的关系则衰退探索和商酌。

增强子可通过相比基因组学寻找[27-29]。在VISTA数据库[30]中，搜索NPTX1高下流100 kb鸿沟内的增强子，仅发现1个序列保守区mm2006（chr17：78，488，791-778，490，654），该保守区经实验考证无增强子活性。活性增强子隔壁富集有几种组卵白修饰，尤其是p300和CREB和解卵白（CREB-binding protein，CBP）介导的H3K27乙酰化修饰[31-32]。染色质免疫共千里淀测序本事（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）依赖于组卵白修饰与特定DNA元件的交联，与DNA序列的保守性无告成关系，有助于探索物种间DNA序列不保守的增强子。咱们通过分析CistromeDB数据库中多种组织H3K27ac的ChIP-seq数据，在东谈主神经源细胞系SH-SY5Y和东谈主肾源细胞系293T上进行双荧光素酶实验，初步探索了NPTX1隔壁的增强子过火在不同组织细胞内的活性。

仪器建设  二氧化碳细胞培养箱、超净责任台（好意思国Thermo Fisher公司）；PCR仪、离神思（德国Eppendorf公司）；Milli-q超纯水系统（德国Millipore公司）。

主要试剂  DMEM培养基、胎牛血清、opti-MEM培养基（好意思国Gibco公司）；Lipo 3000试剂（好意思国Invitrogen公司）；双荧光素酶检测试剂盒（好意思国Promega公司）；2×Taq Mix PCR试剂、无缝克隆试剂盒、质粒小提试剂盒（南京诺唯赞生物有限公司）；去内毒教授粒小提试剂盒（好意思国Omega公司）；DH5a感受态细胞（上海擎科生物有限公司）。

实验细胞系  293T细胞系由复旦大学附庸儿科病院桂永浩课题组赠送。SH-SY5Y细胞系由复旦大学附庸华山病院董强课题组赠送。

商酌起讫时候  2021年12月31日—2022年11月31日。

ChIP-seq数据获取与分析  从CistromeDB数据库中，下载东谈主不同组织开端H3K27ac ChIP-seq的peak数据文献，使用Wang等[33]构建的ChIP-seq数据分析模样，以脑组织为实验组，以肺、肝、肾等数据为对照组，筛选评分为800以上的脑组织中伏击的和特异的H3K27ac富集片断。寻找位于NPTX1高下流100 kb内的H3K27ac富集片断，将这些片断视为假设的NPTX1关系增强子。

富集片断序列保守性分析  使用ECR浏览器，设定DNA分析长度为100 bp，以VISTA数据库中的1个神经系统特异性增强子为参考白丝 hentai，对比分析5个H3K27ac富集片断在东谈主（hg19）、小鼠（mm10）和斑马鱼（danRer7）之间的序列相通性。

增强子活性武断质粒构建  预备带有酶切位点两侧同源序列的引物，PCR赢得两侧带有同源序列的倡导片断。纯化回收酶切载体和倡导片断，将回收居品通过无缝克隆通晓，并滚动至DH5a感受态细胞中；挑选菌落，使用去内毒素试剂盒抽提质粒并测序，以考证质粒序列。

细胞转染与双荧光素酶活性检测  取出冻存细胞系，在6 cm细胞培养皿中，使用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液复苏和培养细胞。待细胞密度达到80%~90%时，群交淫乱消化、稀释细胞并接种于24孔板中。接种12 h后，配制转染混杂物：取一EP管加入25 μL Opti-MEM，1.5 μL Lipofectamine 3000；取另一EP管加入25 μL Opti-MEM、2 μL P300、500 ng待检测质粒和20 ng pRL-TK质粒。将两个EP管践诺物混杂，静置10 min，吸取沿途混杂物加入至24孔板的细胞培养基中。转染24 h后，吸去细胞培养基，使用PBS溶液清洗细胞2次。加入100 μL细胞裂解液，置于摇床30 min后，每孔取50 μL细胞裂解液，蜕变至96孔酶标板中。使用酶标仪检测，先加入50 μL溶液Ⅰ，检测萤光亮度rum1；再加入50 μL溶液Ⅱ，检测萤光亮度rum2。使用rum1/rum2赢得双荧光素酶活性比值rate1。每种待检测质粒作念3个复孔。pGL3-E1b为阴性对照组，pGL3-SV40-Promoter为阳性对照组。各孔的rate1除以同批次pGL3-E1b的rate1平均值，即为该孔的双荧光素酶相对活性R。在SH-SY5Y细胞系上检测赢得的双荧光素酶相对活性计为RS。每孔的rate1除以归并申报质粒的RS，即为该片断的相对增强子活性。

统计学分析  所额外据使用GraphPad Prism 9.0分析处理，数据成果用x±s示意，两组数据之间相比禁受单成分方差分析。P＜0.05为相反有统计学意旨。

东谈主NPTX1两侧100 kb内发现5个H3K27ac富集片断  咱们从CistromeDB数据库中下载了多个组织的H3K27ac数据集，使用Wang等[33]斥地的增强子分析和评分模样，在NPTX1高下流100 kb的鸿沟内，共发现5个H3K27ac的富集片断（表 1），均位于NPTX1基因两侧（图 1）。将每个富集片断轮番定名为NPTX1-E1至NPTX1-E5，其中NPTX1-E1仅为脑组织伏击片断，NPTX1-E2为脑组织伏击且特异性片断，NPTX1-E3、NPTX1-E4、NPTX1-E5仅为脑组织特异性片断。

5个富集片断的序列保守性较低  增强子具有一定的生物功能，其在进化历程中受到一定的不断，尤其是对生物发育有伏击作用的增强子[34]。借助ECR浏览器，咱们评估了5个富集片断在东谈主、小鼠和斑马鱼之间的序列保守性。相对于记载在VISTA增强子数据库[30]中的保守性增强子，NPTX1-E1、NPTX1-E3、NPTX1-E4和NPTX1-E5的DNA序列在东谈主（hg19）、小鼠（mm10）和斑马鱼（danRer7）之间的序列相通性较低（图 2）。NPTX1-E2在东谈主和小鼠间序列相通性为77.7%，但在东谈主和斑马鱼之间相通度低。由此可见5个富集片断在3个物种间的保守性较低。

在东谈主神经源细胞系SH-SY5Y中武断出1个增强子片断  通过PCR扩增，得手扩增出4个片断，定名为NPTX1-E1-P至NPTX1-E4-P，这些片断包含圆善的H3K27ac富集片断过火两侧各500~600 bp的DNA序列。借助无缝克隆本事，得手将4个片断鉴识插入双荧光素酶考证载体中，在东谈主神经源SH-SY5Y细胞系上检测增强子活性。实验成果知道，在SH-SY5Y细胞系中，NPTX1-E1-P的双荧光素酶相对活性比值显着高于阴性对照组（3.41±0.09 vs. 1.00±0.12，P＜0.000 1），而另外3个片断的双荧光素酶活性比值则低于阴性对照组（图 3B），讲解NPTX1-E1-P在SH-SY5Y细胞系内可显着上调最小运行子下流的基因抒发水平。

NPTX1在不同组织内的增强子活性  为了探索NPTX1-E1-P在不同组织内的增强子活性是否会发生改变，咱们进行了双荧光素酶实验，将在东谈主肾源293T细胞上测得的双荧光素酶活性比值记为RT，在东谈主神经源SH-SY5Y细胞上测得的双荧光素酶活性比值记为RS，用RT/RS示意293T细胞系中的相对增强子活性。实验成果知道（图 4），最小运行子载体pGL3-E1b（1.00±0.07 vs. 1.06±0.05，P=0.41）和泛抒发运行子载体pGL3-SV40（1.00±0.04 vs. 0.99±0.03，P=0.98）在SH-SY5Y和293T细胞系中的rate1/RS相反无统计学意旨，而NPTX1-E1-P在293T细胞中的双荧光素酶活性显着低于SH-SY5Y（0.60±0.05 vs. 1.00±0.05，P＜0.000 1），讲解NPTX1-E1-P在293T细胞系内的增强子活性显着镌汰。

咱们在东谈主NPTX1基因两侧识别并武断了1个序列保守进度较低的增强子NPTX1-E1-P，该增强子可在东谈主神经开端的SH-SY5Y中上调申报基因的抒发水平，且其增强子活性在东谈主肾开端的293T细胞中镌汰。

NPTX1主要在核心神经系统细胞中抒发[2]，在神经系统发育分化[1]、神经突触重塑[3]和神经元凋一火[4]等历程中有伏击作用。关联词，对于NPTX1的抒发调控机制尚不解确。NPTX1的组织特异性抒发部分受到增强子的调控，因而有必要武断可能调控NPTX1的增强子。在本商酌中，增强子NPTX1-E1-P在东谈主神经母细胞开端的细胞系中进展出显着的增强子活性，在东谈主肾上皮细胞开端的细胞系中增强子活性下落，与NPTX1的抒发模式有一定的相通之处，讲解NPTX1-E1-P在NPTX1的抒发调控中可能有一定的作用。

H3K27ac组卵白标识是增强子活性的特征之一，常用于识别基因组中的增强子[16]。此种方式不错一次赢得多数序列，且基本秘籍基因组中的增强子序列，但也囊括多数非增强子序列。在东谈主类胚胎干细胞的商酌中，仅有12%的H3K27ac富集片断具有增强子活性[35]。另一项商酌知道，即使和解H3K27ac、p300、和RNA团员酶Ⅱ的ChIP-seq数据，也唯一不到10%的假设增强子片断具有增强子活性[36]。因此，尽管咱们使用H3K27ac组卵白标识在NPTX1隔壁寻找到5个富集片断，在东谈主神经源SH-SY5Y细胞中考证出有增强子活性的却唯一1个片断。

增强子具有一定的生物功能，其在进化历程中受到一定的不断，尤其是对生物发育有伏击作用的增强子[34]。因此，寻找增强子待定序列的方式之一是寻找倡导基因高下流的序列保守区域。Vista数据库记载了多数经过实验考证的保守性增强子[30]，在其中搜索到NPTX1高下流100 kb鸿沟内存在1个序列保守区mm2006（chr17：78，488，791-778，490，654，mm10），与咱们武断的5个H3K27ac富集片断莫得杂乱，且该区域在小鼠体内未检测到增强子活性。因此，咱们的责任与Vista浏览器的责任互补，进一步完善了NPTX1隔壁的调控元件功能注重。

NPTX1的抒发水平改变与多种肿瘤过火预后关系[8-10， 14-15]，商酌知道抒发量改变与NPTX1运行子区甲基化水平改变关系[9-11]，而其他疾病中NPTX1抒发水平改变的机制尚不解确。多数全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS）的商酌知道，与疾病或特征关系联的变异富集在调控区，尤其是细胞特异性强的增强子区域[25， 37-38]。咱们通过武断NPTX1隔壁的增强子，进一步完善了NPTX1隔壁的调控区功能注重，并探索了与该增强子和解的转录因子，为该区域突变的致病性评估和致病机制探索提供了一定的表面依据。

在本商酌中，咱们通过增强子与靶基因的距离，初步判断NPTX1-E1-P可能调控东谈主NPTX1的抒发。关联词，NPTX1-E1-P两侧也有其他基因，距离最近的是ENDOV，其亦可能调控ENDOV的抒发。此外，增强子与其靶基因的互相作用并非单纯的一双一的关系，NPTX1-E1-P也可能同期调控多个基因。其他增强子也可能逾越更远的距离（＞100 kb）调控NPTX1的抒发。HiC、3C等本事不错初步评估该增强子可能的靶基因，然而该本事分辨率较低，神经系统关系的公开数据库较少，昔日关整个据公开后将进一步分析商酌。亦可通过增强子敲除等本事，进一步细则NPTX1-E1-P的靶基因。

作家孝顺声明  陈旭东  数据收罗、统计和分析，论文构念念、撰写和翻新。张琦  数据审核，论文翻新。张颖蓝，林佳  实验本事提拔。王凤  生物信息学分析本事提拔。桂怡婷，刘婷  图片绘图，数据统计和分析，论文翻新。李强  形态责罚，资金提拔，论文翻新。

利益冲破声明  整个作家均声明不存在利益冲破白丝 hentai。